Как правильно организовать рабочее место микробиолога

Деятельность микробиологической лаборатории должна быть лицензирована, что подтверждает ее компетентность по заявленной области аккредитации. Производственные лаборатории молочных предприятий и организация их деятельности должны соответствовать требованиям санитарных правил СП 1.3.2322–08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН 2.3.4.551–96 «Производство молока и молочных продуктов» и MP 2.3.2.2327–08 «Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на молокоперерабатывающих предприятиях».

В этих документах определены требования к помещениям, расположению и размерам, необходимому оборудованию для каждого помещения, порядок санитарно-гигиенической обработки с целью обеспечения:

• безопасных условий труда;
• необходимого уровня защиты анализируемого объекта от загрязнения микроорганизмами из окружающей среды;
• охраны окружающей среды от загрязнения микрофлорой из анализируемых объектов и их посевов.

Рекомендуемый объем лабораторного помещения на одного сотрудника – не менее 15 м3, площадь – не менее 4,5 м2. Внутренняя отделка помещений должна быть выполнена в соответствии с их функциональным назначением. Поверхности пола, стен, потолка в лабораторных помещениях должны быть гладкими, без щелей, легко обрабатываться, быть устойчивыми к действию моющих и дезинфицирующих средств, полы не должны быть скользкими.

Необходимое количество бактерицидных ламп рассчитывают с учетом их мощности, объема и категории помещения в соответствии с требованиями Р 3.5.1904 и МУ 2.3.975. Структура лаборатории и расположение помещений, входящих в ее состав, зависят от того, проводятся там или нет манипуляции с исследуемыми объектами. В зависимости от этого все помещения подразделяются на условно «заразную» и «чистую» зоны. «Чистая» зона – помещение или группа помещений лаборатории, где не проводятся работы с анализируемыми объектами и микробиологические анализы. В «чистой» зоне располагаются:

• комната для спецодежды;
• кабинет руководителя и комната для работы с документами;
• моечная, оборудованная для мытья посуды;
• средоварочная, оборудованная для приготовления питательных сред;
• подсобные помещения для хранения реактивов, посуды, аппаратуры и хозяйственного инвентаря.

«Заразная» зона – помещение или группа помещений лаборатории, где проводятся работы с анализируемыми объектами и микробиологические анализы. В «заразной» зоне располагаются:

• лабораторная(ые) комната(ы) с ламинарным шкафом или боксом с предбоксником для микробиологических исследований. В предбокснике одевают специальную санитарную одежду (халаты, колпаки, бахиллы), он должен быть оснащен столом для временного размещения вносимых материалов, вешалкой с плечиками и бактерицидными лампами;
• автоклавная, оборудованная автоклавами для обеззараживания отработанного материала и зараженной посуды, а также для подготовки стерильных питательных сред и микробиологической посуды.

Помещения, мебель и оборудование должны быть промаркированы с указанием их назначения по зонам. В лаборатории должны быть:

• раковины с подводом горячей и холодной воды;
• лабораторные столы для стационарной установки приборов (микроскопа, весов и другого оборудования), столы со стульями для учета результатов микробиологических анализов и ведения документации;
• рабочий стол в боксе, снабженный подводом газовой горелки или спиртовками, весами, шейкером для подготовки проб;
• термостаты, минимум три: для выращивания посевов при определении бактерий группы кишечных палочек (37 °С), количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (30 °С), дрожжей и плесеней (26–30 °С). При выпуске кисломолочной продукции также необходимо иметь термостат для выращивания посевов при определении количества молочнокислых бактерий и термостат, используемый при определении бифидобактерий;
• электрическую плитку или водяную баню для расплавления питательных сред;
• холодильник для хранения питательных сред;
• закрытые шкафы для хранения стерильной посуды и готовых питательных сред;
• бактерицидные лампы и (или) другое оборудование, обеспечивающее обеззараживание помещений.

При входе в лабораторию и боксированное помещение должны быть дезинфицирующие коврики размером 90х60 см.

Работы с заквасками (получение лабораторной закваски, активизация заквасок прямого внесения), если такие осуществляются, следует проводить в отдельном помещении, оснащенном столами, термостатами, бактерицидной лампой и (или) другим оборудованием, обеспечивающим обеззараживание помещения. Производственную закваску получают в специализированном заквасочном помещении, не связанном с производственной лабораторией.

Для проведения микробиологических анализов лаборатория должна быть оснащена необходимым количеством лабораторной посуды: колбы, стаканы, мензурки, пипетки градуированные, ковши, кастрюли и т.д. Кроме того, для микробиологических посевов необходимы пипетки с одной отметкой номинальной вместимостью 1 мл, чашки Петри диаметром 90 мм (ЧБН-1-100 и ЧБН-2), пробирки стеклянные П1-16(21)-150(200)ТС или П2-16(21)-150(200)ТС или одноразовую посуду аналогичного назначения.

В лаборатории должна быть вся необходимая документация по методам отбора проб и подготовке их к анализу для проведения микробиологических исследований, микробиологическим и инструментальным методам контроля микроорганизмов в молочном сырье, применяемых в технологии компонентов, воды, смывов с оборудования, продукции, контролю санитарной гигиены работников.

Подготовка посуды и материалов

Одним из важнейших факторов, влияющих на получение объективных результатов микробиологических анализов сырья, компонентов, смывов с оборудования, молочной продукции и других контролируемых объектов, является правильная подготовка питательных сред, посуды, материалов и реактивов. Все операции проводят в соответствии с действующей нормативной документацией: ГОСТ 32901–2014 (вступил в действие с 01.01.2016 г.); МР 2.3.2.2327–08 «Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях молочной промышленности»; Методические рекомендации по организации производственного микробиологического контроля на предприятиях цельномолочной и молочно-консервной промышленности (регистрационное свидетельство № 12253 от 26.02.2009 г.); МУК 4.2.1991–05 «Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы». Всю посуду, реактивы и питательные среды следует использовать в соответствии с действующими нормативными документами, в частности ГОСТ 25336.

Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике.

Различают термическую и холодную стерилизацию.

Способы термической стерилизации:

— прокаливание в пламени и обжигание;

— сухожаровая стерилизация (горячим воздухом);

— стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование);

— дробная стерилизация (тиндализация);

— кипячение.

Методы холодной стерилизации:

— стерилизация фильтрованием (применяются специальные стерильные фильтры с определенным размером пор);

— газообразными средствами;

— ультрафиолетовыми лучами и другими видами излучений.

Целесообразность применения того или иного способа определяется в первую очередь физико-химическими свойствами материала, подлежащего стерилизации, а иногда и целью исследования.

Новую посуду (за исключением одноразовой стерильной пластиковой посуды) кипятят в подкисленной воде (раствор соляной кислоты с объемной долей 1–2 %) в течение 15 мин, а затем ополаскивают дистиллированной водой. Вспомогательное оборудование для отбора проб (мутовки, черпаки, трубки, щупы, ложки, емкости и др.), посуду (стеклянные чашки Петри, пробирки и пипетки, фарфоровые ступки с пестиками, резиновые пробки и др.), некоторые реактивы (например, раствор двууглекислого натрия, применяемого для нейтрализации проб при контроле кисломолочных продуктов и производственной закваски) подвергают стерилизации.

Посуда с посевами на питательных средах после учета результатов обязательно обеззараживается путем стерилизации в автоклаве при 121±1 °С, т.е. 1 атм, в течение 90±1 мин или кипячением в течение 1 ч, а для инактивации споровых микроорганизмов – при 132±2 °С в течение 90±1 мин. Если посуда плохо отмывается, то ее дополнительно обрабатывают путем погружения в раствор хромпика (раствор двухромового калия в серной кислоте) с последующим тщательным ополаскиванием водопроводной водой, дистиллированной водой и высушиванием в сушильном шкафу. Нельзя мыть посуду дезинфицирующими средствами.

При подготовке стеклянной посуды в конец пипеток (который при проведении посевов вставляют в грушу или специальный держатель для пипеток) вкладывают кусочек ваты. Чистую посуду заворачивают в бумагу (пергамент, подпергамент, крафт-бумагу, но не в газету!) или помещают в специальные металлические пеналы и стерилизуют в сушильном шкафу при 175±5 °С в течение 1 ч, или при 160±5 °С в течение 2 ч, или автоклавированием при 121±1 °С в течение 30 мин с последующим подсушиванием в сушильном шкафу. Стерильную посуду хранят в плотно закрывающихся шкафах или ящиках с крышками. Срок хранения подготовленной стерильной посуды – не более 30 сут. В случае применения одноразовой стерильной посуды ее следует использовать только до указанного срока годности. Следует помнить, что после использования одноразовая посуда также автоклавируется с последующей утилизацией специальными организациями, что должно подтверждаться соответствующими документами.

 

Приготовление питательных сред и реактивов

Подготовку питательных сред и реактивов проводят в соответствии с названными выше документами, руководствуясь способом приготовления, который указан на этикетке единичной упаковки питательной среды. Питательные среды подразделяют на жидкие, полутвердые и твердые, что обусловлено различным содержанием в их составе микробиологического агара. Жидкие и полутвердые питательные среды разливают в зависимости от необходимости в пробирки или колбы, а плотные питательные среды – в колбы с последующим розливом в чашки Петри. Готовые для посевов питательные среды выпускают и в сухой форме. Для восстановления сухих питательных сред используют дистиллированную или подготовленную питьевую воду. Для этого водопроводную воду кипятят в открытом сосуде (емкости) в течение 30 мин. Активная кислотность воды, используемой для приготовления реактивов и большинства питательных сред, должна быть в пределах от 6,8 до 7,4 ед. рН. Дистиллированная вода, получаемая в дистилляторах разного типа, может отличаться уровнем активной кислотности.

При приготовлении питательных сред необходимо контролировать активную кислотность до и после стерилизации. Следует помнить, что при стерилизации активная кислотность питательных сред понижается на 0,4±0,2 ед. рН. Для установления требуемой величины активной кислотности в питательной среде рекомендуется применять 20 %-ный раствор гидроокиси натрия или 20 % -ный раствор молочной кислоты. Необходимо строго соблюдать инструкцию по приготовлению питательных сред. Для дополнительного контроля соблюдения режимов стерилизации питательных сред на них наклеивают специальные индикаторы, метки на которых в процессе стерилизации изменяют цвет. После автоклавирования цвет метки индикатора сравнивают с контролем, если цвет изменился, то это косвенно свидетельствует о соблюдении режимов стерилизации. Стерильность готовой питательной среды определяют визуально путем просмотра 3–5 % каждой партии после инкубации в термостате при 37 °С в течение 2–14 сут в зависимости от типа среды.

Обнаружение после инкубации помутнения жидкой (полужидкой) среды или появление на чашках (пробирках) более 2–4 колоний свидетельствует о нестерильности среды. Вся исследуемая среда в этом случае подлежит повторному контролю на удвоенном количестве образцов. При повторном подтверждении результата среда подлежит уничтожению.

Важно, что к работе с автоклавами допускаются только специально обученные сотрудники. В настоящее время требуется проверять качество питательных сред, т.е. их чувствительность к тем микроорганизмам, для контроля которых их применяют. Качество питательных сред контролируется в соответствии с МУК 4.2.2316–08 «Методы контроля бактериологических питательных сред». Поскольку для определения качества питательных сред требуются специальные тест-микроорганизмы, то данный вид контроля рекомендуется осуществлять в лабораториях Роспотребнадзора. Все питательные среды и реактивы следует использовать строго в соответствии со сроком их годности.

Входной контроль сырья и материалов

Для обеспечения выпуска качественной и безопасной продукции на предприятии осуществляют: входной контроль молочного сырья, компонентов и материалов; технологический контроль, т.е. контроль по ходу производства каждого продукта; контроль готовой продукции. По такому же принципу распределяется работа микробиологической лаборатории: входной контроль молочного сырья, компонентов и материалов, поступающих на предприятия молочной промышленности; микробиологический контроль по ходу технологических процессов; микробиологический контроль готовых продуктов; приготовление и контроль лабораторных заквасок, активизация бактериальных концентратов; контроль заквасок; контроль санитарно-гигиенического состояния производства (смывов с оборудования, инвентаря, рук сотрудников, спецодежды и др.); контроль воздуха и воды; мониторинг бактериофагов на предприятии.

Входной контроль следует осуществлять:

• по сопроводительным документам;
• органолептическим показателям;
• физико-химическим показателям;
• микробиологическим показателям;
• дополнительным показателям при выявлении фальсификации поступающего сырья и компонентов.

Молокоперерабатывающие предприятия вырабатывают широкий ассортимент молочной и молокосодержащей продукции, поэтому необходимо контролировать микробиологические показатели не только молочного сырья (сырые и сухие молоко, сливки, обезжиренное молоко, сыворотка, пахта; сгущенные молочные продукты, масло сливочное), но и всех используемых немолочных компонентов. Безусловно, основным объектом контроля является молочное сырье, поскольку оно может содержать разнообразные виды микроорганизмов: молочнокислые, микрококки, сарцины, энтерококки, стафилококки, сальмонеллы, листерии, палочки Протея, маслянокислые бактерии, флуоресцирующие и другие бактерии, а также возбудителей некоторых заболеваний. С этим связано нормирование микробиологических показателей в сыром молочном сырье, в котором в соответствии с ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» нормируется количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), а также патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы.

Практически все компоненты, применяемые в технологии молочной продукции, имеют определенную бактериальную обсемененность, и поэтому при поступлении партий товара на предприятия их следует контролировать по микробиологическим показателям. Хотелось бы обратить внимание и подчеркнуть важность контроля микробиологических показателей немолочных компонентов, так как содержащиеся в них микроорганизмы, попадая в молочное сырье, как правило, активно размножаются.

Так, например, сахар, широко применяемый в производстве молочной продукции, может не только подавлять развитие микрофлоры за счет повышения осмотического давления в пищевой системе, но и служить источником бактериальной обсемененности. При повышенной массовой доле влаги в сахаре (более 0,15 %) количество микроорганизмов может достигать несколько тысяч в 1 г. Наибольшую опасность для производства представляют осмофильные дрожжи; спорообразующие термофильные и мезофильные аэробы и анаэробы; термофильные бактерии, образующие газы (Н2S, СО2); слизеобразующие неспороносные бактерии, споры и конидии плесневых грибов и др. Эти микроорганизмы способны вызывать различные пороки: усиленное брожение, увеличение кислотности, изменение консистенции, особенно в продуктах с фруктовыми добавками. В сахаре следует определять количество дрожжей и плесеней, а также бактерии группы кишечных палочек (должны отсутствовать в 1 г продукта).

При производстве молокосодержащей продукции часто применяются заменители молочного жира (растительные масла и их смеси), в которых КМАФАнМ может составлять порядка 100 КОЕ/г. Наиболее частыми возбудителями порчи растительных масел являются бактерии из группы клостридиум путрификум и маслянокислые бактерии, использующие продукт гидролиза жиров – глицерин. Растительные масла подвергаются микробной порче незначительно. Это объясняется тем, что микроорганизмы, расщепляющие жиры, встречаются реже, чем микроорганизмы, воздействующие на углеводы и белки. В чистых жирах мало минеральных питательных веществ, а также почти отсутствует вода, необходимая для жизнедеятельности микроорганизмов. Однако микрофлора растительных жиров, попадая вместе в молочную основу, начинает развиваться, что в дальнейшем может служить причиной возникновения пороков готового продукта. Поэтому в заменителях молочного жира следует контролировать КМАФАнМ.

В производстве молочной продукции широко применяют фруктово-ягодные наполнители, но далеко не на всех предприятиях эти компоненты контролируют по микробиологическим показателям. Фруктово-ягодные добавки в зависимости от их термообработки и способов упаковки (герметичная или негерметичная) могут содержать дрожжи, плесени, гетероферментативные молочнокислые бактерии, уксуснокислые бактерии. Во фруктово-ягодных компонентах следует определять количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а также наличие дрожжей и плесеней, которые могут приводить к возникновению пороков молочной продукции.

В технологии мороженого, глазированных сырков применяют различные виды глазури. Шоколадная, молочная, фруктовая и другие виды глазури, а также шоколад, какао-порошок и другие какао-продукты чаще всего загрязнены спорами Bacillus, в меньшей степени – осмофильными дрожжами и плесневыми грибами.

Показатели безопасности немолочных компонентов (какао и какао-продуктов, мучных кондитерских изделий – печенья, вафель и др., отрубей пищевых, пищевых волокон, пектинов, орехов, камедей, желатина, агар-агара, крахмала и продуктов его переработки, овощей сухих, грибов и др.), применяемых в производстве молочных продуктов, в том числе с заменителем молочного жира, нормируются в ТР ТС 021/2011. Этот документ предусматривает контроль мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов; бактерий группы кишечных палочек; патогенных, в том числе сальмонелл; дрожжей; плесеней; стафилококков; сульфитредуцирующих клостридий.

 

Отбор и подготовка проб молока и молочной продукции для микробиологического анализа

Важными этапами в получении достоверных результатов микробиологических анализов молочного сырья, молочных, молочных составных и молокосодержащих продуктов являются правильный отбор проб и подготовка их к анализу. При этом руководствуются межгосударственными стандартами ГОСТ 26809.1–2014 «Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты» и ГОСТ 26809.2–2014 «Молоко и молочная продук-ция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 2. Масло из коровьего молока, спреды, сыры и сырные продукты, плавленые сыры и плавленые сырные продукты».

В данных международных стандартах приводятся термины и определения: единица продукции, штучная продукция, нештучная продукция, выборка, объем выборки, проба, точечная проба, объединенная проба, проба для анализа, лабораторная проба, бескорковый сыр, корковый сыр, масса сырная, внутренний контроль, внешний контроль. Чрезвычайно важно знать, что понимается под партией продукции и какой объем выборки необходимо провести от партии продукции для осуществления анализов. Под партией понимают совокупность единиц продукции одного наименования, однородной по составу и качеству, в однородной таре (упаковке), произведенной на одном предприятии в соответствии с одним техническим документом, на однотипном технологическом оборудовании, в течение одного технологического цикла, по единому производственному режиму, одной даты изготовления, сопровождаемой товаросопроводительной документацией, которая обеспечивает прослеживаемость. На первом этапе определяют объемы выборки от партий молочного сырья и всех видов молочной продукции, зависящие от числа единиц транспортной упаковки с продукцией, и партий, которые приводятся в названных выше ГОСТах. Затем проверяют состояние упаковки (внешний вид, маркировка) и устанавливают однородность партии. Следует помнить, что размер отобранных проб должен обеспечить представительность выборки продукции. Пробы для микробиологических анализов отбираются первыми стерильным оборудованием (одноразовыми стерильными инструментами) в стерильные емкости (одноразовую стерильную посуду) или единичные упаковки, отдельно от проб для органолептических и физико-химических анализов. Последовательность всех операций при отборе проб по каждому виду молочной продукции подробно изложена в ГОСТ 26809.1–2014 и ГОСТ 26809.2–2014. Хотелось бы подчеркнуть, что для получения достоверных результатов микробиологических исследований не следует уменьшать количество и массу отбираемых точечных проб, из которых обязательно вначале составляют объединенную пробу, а затем из нее отбирают пробу для анализа. При составлении объединенной пробы число точечных проб от каждой единицы упаковки, включенной в выборку, должно быть одинаковым. Необходимо отметить, что для разных групп молочной продукции существуют отличия в правилах составления объединенных проб из точечных проб продукции. Например, жидкие кисломолочные продукты в потребительской упаковке без добавок или с добавками, которые образуют с продуктом однородную структуру, перемешивают путем пятикратного перевертывания упаковки, вскрывают и переливают в стерильную емкость, из которой отбирают лабораторную пробу для микробиологического анализа. При составлении объединенной пробы мороженого в потребительской упаковке вначале продукцию освобождают от упаковки, а затем в условиях асептики с помощью стерильного пинцета или шпателя очищают от глазури, вафель. Очищенное мороженое помещают в стерильную закрывающуюся посуду и выдерживают при комнатной температуре до полного оттаивания. Из оттаявшей массы отделяют орехи, цукаты, изюм и другие наполнители и составляют объединенную пробу. Минимальная масса объединенной пробы для разных групп продукции указана в ГОСТ 26809.1–2014 и ГОСТ 26809.2–2014. Для идентификации отобранных проб необходимо четко маркировать используемые стерильные емкости с помощью этикеток или надписей специальными маркерами с обязательным составлением акта отбора проб. Если есть необходимость в доставке отобранных проб продукции в лабораторию, то вначале их пломбируют или опечатывают. Пробы продукции должны быть сразу отправлены в лабораторию. Транспортируют пробы при 2–8 °С, пробы мороженого – не выше минус 2 °С, для чего используют термоизолированные емкости и переносные сумки-холодильники. Продолжительность доставки и хранения проб продукции для анализа должна быть не более 24 ч после их отбора. Консервирование проб молочной продукции для микробиологических анализов не допускается!

 

Подготовка лабораторных проб продукции для микробиологического анализа

Для микробиологических анализов из объединенной пробы продукции готовят лабораторную пробу. Для всех видов продукции следует добиться однородности объединенной пробы путем перемешивания (допускается прогревание пробы при 30–34 °С с последующим ее охлаждением до 18–22 °С), измельчения (для сыров, сырных продуктов), перетирания (для пастообразной продукции) или гомогенизации, после чего отбирают лабораторную пробу. Оставшуюся объ-единенную пробу хранят при рекомендуемых для данного вида продукции условиях вплоть до получения окончательных результатов микробиологических анализов. Кисломолочные продукты с газообразующей микрофлорой (кефир, кефирный напиток, кумыс и др.) перед проведением анализов выливают в стерильный химический стакан, закрывают фольгой, помещают на водяную баню при 32±2 °С и выдерживают 10±1 мин, периодически перемешивая для удаления углекислоты. После этого пробу охлаждают до 20±2 °С и подвергают анализу. Пробы жидких кисломолочных продуктов и производственных заквасок обязательно в асептических условиях следует нейтрализовать: на 10 см3 продукции вносят 1 см3 10 %-ного стерильного раствора питьевой соды, тщательно перемешивают и только потом исследуют. Микробиологические анализы проводят сразу же после подготовки лабораторной пробы.

 

Методы микробиологических исследований молочной продукции и окружающей среды

В соответствии с действующими нормативно-правовыми документами (ТР ТС 021/2011, ТР ТС 033/2013, ТР ТС 027/2012 и др.) в молочной продукции регламентируются микробиологические показатели, которые относят к показателям безопасности. От точности определения этих показателей зависят и качество, и безопасность продуктов питания. Точность получаемых результатов обусловлена применяемыми методами, средствами для их реализации и квалификацией персонала. Микробиологические исследования сырья, ингредиентов, полуфабрикатов и готовой продукции возможны лишь на основе использования методов, изложенных в ГОСТах и других документах, утвержденных в установленном порядке.

Методы микробиологического контроля разделяют по назначению, принципу действия, трудозатратам и продолжительности. По назначению методы микробиологического контроля подразделяют:

• на количественные, применяемые для определения количества микроорганизмов в определенном объеме контролируемого продукта (полуфабриката);
• качественные, предназначенные для простого выявления присутствия или отсутствия микроорганизмов в определенном объеме контролируемого объекта.

По принципу действия методы микробиологического контроля подразделяют на биохимические, иммунологические, импедансный, люминесцентные, флюорисцентные, ПЦР-диагностики и др. По трудозатратам и продолжительности различают традиционные микробиологические методы и экспресс-методы.

Экспресс-методы микробиологических анализов пока не нашли широкого применения в лабораториях предприятий, что обусловлено следующими причинами:

• достаточно высокая стоимость приборов;
• использование приборов целесообразно, как правило, для контроля большого количества проб (для крупных предприятий и лабораторий);
• необходимость специального обучения сотрудников для работы на приборе и определенных затрат на обслуживание приборов.

В настоящее время при контроле микробиологических показателей молочной продукции руководствуются ГОСТ 32901–2014 и нормативными документами на конкретный вид продукции. В ГОСТ 32901–2014 (введен в действие 01.01.2016 г.) изложены методы определения бактериальной обсемененности молочного сырья; количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ); бактерий группы кишечных палочек (БГКП) и дифференциации энтеробактерий на среде Эндо; технически вредных микроорганизмов молока и продуктов его переработки (психротрофные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, термофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы); спор аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов; промышленной стерильности; методы микроскопических испытаний. ГОСТ 10444.12–2013 и ГОСТ ISO 6611–2013 следует применять для выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов; ГОСТ 10444.11–2013 – для выявления и подсчета количества мезофильных молочнокислых микроорганизмов;

ГОСТ ISO 29981–2013 – для определения количества бифидобактерий. При определении других групп микроорганизмов, нормируемых в молочной продукции, применяют следующие ГОСТы: для Staphylococcus aureus – ГОСТ 30347; для Salmonella –31659–2012; для Listeria monocytogenes – 32031–2012; для Bacillus cereus – ГОСТ 10444.8; для Enterobacter sakazakii – МУК 4.2.2428–08.

Вода, используемая в процессе производства молока и молочной продукции, должна соответствовать требованиям ТР ТС «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011). Воздух желательно контролировать аспирационным методом, который позволяет более объективно оценить микробиологические показатели воздушной среды. Колонии микроорганизмов идентифицируют путем микроскопирования, а также с помощью биохимических и серологических методов с применением тест-систем API 20E и Rapid 20 E, которые зарегистрированы в России. С целью модернизации, упрощения, снижения риска человеческого фактора и расходов на проверку питательных сред при проведении микробиологических анализов рекомендуется применять петрифильмы (МУК 4.2.2884–11 «Методы микробиологического контроля объектов окружающей среды и пищевых продуктов с использованием петрифильмов»). Определяя микробиологические показатели сырья и компонентов, используемых в производстве молочной продукции, не следует забывать об актуализации фонда нормативных документов.

 

Микробиологический контроль питьевого молока и сливок

Молоко питьевое в соответствии с ГОСТ 31450–2013 в зависимости от режимов термической обработки подразделяют на пастеризованное, топленое, стерилизованное и ультрапастеризованное, а сливки питьевые по ГОСТ 31451–2013 – на пастеризованные, стерилизованные и ультрапастеризованные. В соответствии с ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 033/2013 в пастеризованном, топленом и ультрапастеризованном молоке без асептического розлива, а также в пастеризованных и ультрапастеризованных сливках без асептического розлива нормируются следующие виды микроорганизмов: количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ); бактерии группы кишечных палочек (БГКП); патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы; стафилококки Staphylococcus аureus; листерии Listeria monocytogenes. Однако допустимые уровни содержания перечисленных выше микроорганизмов отличаются, что обусловлено различными режимами тепловой обработки и видами упаковки (потребительская или во флягах и цистернах), которые применяются в технологии данных видов продуктов. Стерилизованные и ультрапастеризованные питьевое молоко и сливки с асептическим розливом должны соответствовать требованиям промышленной стерильности.

С целью выполнения установленных допустимых норм содержания микроорганизмов в питьевом молоке и сливках на предприятиях осуществляют входной и технологический контроль. Микробиологические показатели готового питьевого молока и сливок во многом зависят и от соблюдения параметров технологических процессов, санитарно-гигиенических условий на предприятии и периодичности проведения контроля. Поэтому очень важно на каждом предприятии в зависимости от используемого оборудования правильно установить критические контрольные точки и периодичность их контроля, которые отражаются в Программе производственного контроля. Хотелось бы еще раз обратить внимание сотрудников микробиологических лабораторий на необходимость изучения ГОСТов на методы микробиологического контроля и грамотное их применение в практической деятельности. К наиболее частым причинам превышения допустимых норм содержания микроорганизмов в питьевом молоке и сливках относят нарушение санитарно-гигиенических условий на предприятиях, а также правил отбора проб в части уменьшения количества и массы отбираемых точечных проб для составления объединенной пробы, из которой проводят отбор для проведения анализов микробиологических показателей. Пробы питьевого молока и сливок отбирают и подготавливают к анализам по ГОСТ 26809.1–2014 «Молоко и молочная продукция. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу. Часть 1. Молоко, молочные, молочные составные и молокосодержащие продукты». Объем пробы питьевого молока или сливок, предназначенной для анализа, должен составлять не менее 0,5 дм3. Пастери зованное молоко или сливки, топленое молоко в потребительской упаковке (бутылках, пакетах и т.д.), попавшие в выборку, перед отбором проб перемешивают пятикратным переворачиванием. При контроле стерилизованного и ультрапастеризованного (с асептическим розливом) молока или сливок от каждой партии продуктов отбирают необходимое количество потребительских упаковок (банок, бутылок, пакетов и др.) общим объемом не менее 1 дм3, но не менее двух единиц. В дальнейшем подготовку и проведение микробиологических анализов пастеризованного молока и сливок, топленого молока проводят по ГОСТ 32901–2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа» (с поправками), в котором изложены методы определения КМАФАнМ, БГКП, промышленной стерильности и др. При проведении микробиологических анализов продуктов перед посевом готовят десятикратные разведения в стерильных растворах хлористого натрия или разбавленного фосфатного буфера (как правило, используется для продуктов детского питания). Приготовленные разведения должны быть использованы в течение не более 45 мин после их приготовления. Следует подчеркнуть, что по ГОСТ 32901–2014 первое разведение получают путем внесения 10 см3 пробы в 90 см3 стерильного физиологического раствора. Ряд последовательных разведений получают из первого, используя пробирки с 9 см3 стерильного физиологического раствора. Из первого разведения 1:10 готовят последующие (1:100 и т.д.), беря 1 см3 предыдущего разведения и добавляя его в пробирку с 9 см3 раствора для разведений.

Определение КМАФАнМ и БГКП в питьевом молоке и сливках, топленом молоке, ультрапастеризованном молоке без асептического розлива проводят по ГОСТ 32901–2014, в котором последовательно излагаются ход анализа и учет результатов. Стерилизованное молоко и сливки, а также ультрапастеризованное (с асептическим розливом) молоко и сливки контролируют методом определения промышленной стерильности по ГОСТ 32901–2014. Сущность метода заключается в способности микроорганизмов, выдержавших стерилизацию, размножаться в стерильных продуктах при оптимальных режимах термостатной выдержки и вызывать в нем органолептические и (или) микробиологические и (или) физико-химические изменения. Допустимые уровни содержания патогенных микроорганизмов, в том числе сальмонелл, стафилококков Staphylococcus аureus, листерий Listeria monocytogenes в пастеризованном молоке и сливках, топленом молоке и ультрапастеризованном (без асептического розлива) молоке и сливках контролируют в специально аккредитованных лабораториях с учетом соответствующих правил безопасности. Стафилококки определяют по ГОСТ 30347–97.

Методы контроля санитарно-показательных микроорганизмов

Санитарно-показательные микроорганизмы – это микроорганизмы, постоянно обитающие в кишечнике человека и животных, по наличию в пищевых продуктах которых судят о возможном присутствии патогенных и токсигенных видов микробов. Контроль за количеством и наличием санитарно-показательных микроорганизмов позволяет выявлять уровень загрязнения окружающей среды, а, следовательно, и степень эпидемиологической опасности: чем выше количество санитарно-показательных микроорганизмов, тем выше вероятность присутствия потенциально опасных микроорганизмов в исследуемом объекте. К санитарно-показательным микроорганизмам относят: бактерии группы кишечных палочек – БГКП (колиформы) и количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ).

Бактерии группы кишечных палочек (БГКП) являются основными санитарно-показательными микроорганизмами, которые объединяют 3 рода микроорганизмов – Escherichia, Citrobacter, Enterobacter, входящих в семейство Enterobacteriaceae и обладающих многими общими морфологическими, культуральными и ферментативными свойствами. К БГКП относят мелкие подвижные грамотрицательные, не образующие спор палочки, не обладающие оксидазной активностью, ферментирующие лактозу и глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 °С (в течение 5–24 ч). Среди БГКП наибольшее санитарно-показательное значение имеют бактерии рода Escherichia. По Международным стандартам нормируются колиформные, т.е лактозоположительные кишечные палочки, которые способны сбраживать лактозу при 37 °С.

Обнаружение в пищевых продуктах, воде, смывах с оборудования, рук и санитарной одежды работников предприятий бактерий группы кишечных палочек рода Escherichia свидетельствует о свежем, а Citrobacter и Enterobacter – более давнем фекальном загрязнении объектов. Поэтому бактерии рода Escherichia имеют большее санитарно-показательное и эпидемиологическое значение. БГКП способны размножаться в пищевых продуктах, в частности, в молоке, при этом увеличивая его кислотность и образуя неровный ноздреватый сгусток. Как правило, тепловая обработка сырья в ходе технологического процесса приводит к гибели БГКП, хотя имеются данные, что может происходить автоселекция клеток кишечных палочек в сторону увеличения их устойчивости к действию высоких температур. В настоящее время иногда выявляют кишечные палочки с пониженной способностью к газообразованию и устойчивые формы к кислоте (рН 4,5).

БГКП определяют по ГОСТ 32901–2014 «Молоко и молочная продукция. Методы микробиологического анализа». Метод основан на способности БГКП сбраживать в питательной среде лактозу с образованием газа и кислоты при 37 °С в течение 24 ч, а для мороженого – 48 ч. Признак роста БГКП на жидкой среде Кесслер – визуально наблюдаемое накопление газа в поплавке. Согласно ГОСТ 32901–2014 при выборе разведений следует засевать три последовательных разведения, среднее из которых соответствует нормируемому. В качестве селективной среды для выявления и дифференцирования БГКП используют среду Эндо, содержащую фуксин, на которой E. coli дает характерный рост в виде колоний красного цвета с металлическим блеском.

ГОСТ 32901–2014 предусматривает дифференциацию энтеробактерий на лактозоположительные (БГКП) и лактоотрицательные (патогенные сальмонеллы и шигеллы) по виду образуемых на среде Эндо колоний. Образование колоний красного или темно-красного цвета с металлическим блеском говорит о принадлежности микроорганизмов к лактозоположительным энтеробактериям (БГКП). Для окончательной дифференциации проводят оксидазный тест, окрашивание по Граму и проверяют ферментацию лактозы. Образование полупрозрачных бесцветных или бледно-розовых колоний говорит о принадлежности микроорганизмов к лактозоотрицательным, в том числе патогенным энтеробактериям.

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов относят к санитарно-гигиеническим показателям, которые позволяют характеризовать условия производства, хранения и транспортирования продуктов питания. Количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов определяют по ГОСТ 32901–2014 традиционным методом глубинного посева контролируемого объекта (в требуемом объеме) на твердую питательную среду КМАФАнМ с последующим культивированием при 30 °С в течение 72 ч и подсчетом колоний. Количество колоний выражают в КОЕ (колониеобразующих единицах) в единице объема или массы продукта. Количество засеваемого объема устанавливают с учетом наиболее вероятного микробного обсеменения в соответствии с объемом или массой продукта, рекомендуемыми ГОСТ 32901–2014. При определении КМАиФАнМ выбирают те разведения, при посеве которых на чашках Петри вырастает от 15 до 300 колоний. При проведении анализа следует осуществлять посев трех последовательных разведений, среднее из которых соответствует нормируемому. Каждое разведение должно быть засеяно в количестве 1 см³ в одну чашку Петри с заранее маркированной крышкой и залито 14±1 см³ расплавленной и охлажденной до 40–45 °С питательной средой для определения КМАиФАнМ, приготовленной по ГОСТ 32901–2014. После застывания среды чашки с посевами переворачивают крышками вниз и помещают в термостат при 30 °С на 72 ч. После термостатирования посевов подсчитывают колонии, выросшие на каждой чашке в соответствии с ГОСТ 32901–2014.

При осуществлении на предприятии внутреннего контроля БГКП и КМАиФАнМ можно выявлять с применением пластин «Петрифильм» или инструментальных методов, в частности на приборах серии «Бак Трак» или других анализаторах.

 

Методы контроля молочнокислых бактерий в молочной продукции

Особая роль в технологии многих молочных продуктов, включая новые виды кисломолочной продукции, отводится закваскам.

Наиболее широко в составе заквасок используются мезофильные и термофильные молочнокислые бактерии; пробиотические бактерии; специальные штаммы плесеневых грибов (в сыроделии); дрожжи, сбраживающие и несбраживающие лактозу (в производстве кефира, кефирных напитков, «Кумыса», «Тана», «Айрана» и других продуктов). Состав микрофлоры закваски обусловливает ее назначение и вид. Закваски используются для производства большого ассортимента кисломолочных продуктов, сыров, кисломолочного мороженого, кислосливочного масла, напитков из сыворотки и другой продукции. Закваски, применяемые в биотехнологии молочной продукции, состоят из штаммов микроорганизмов различных таксономических групп, а именно родов Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Acetobactor, Saccharomyces, Penicillium, Brevibacterium. Бактерии, относящиеся к Lactococcus, Leuconostoc, Lactobacillus и Streptococcus, часто называют молочнокислыми, так как они в основном активно развиваются в молоке. Одним из важнейших свойств различных видов молочнокислых бактерий является их способность ферментировать молочный сахар – лактозу с образованием молочной кислоты (гомоферментативное брожение) или молочной кислоты, ароматических веществ и газов (гетероферментативное брожение). Процессы гомо- и гетероферментативного брожения зависят от вида культур, входящих в состав заквасок.

Закваски подразделяют:

• по числу штаммов в составе заквасок: монозакваски, которые состоят из одной культуры; полизакваски или многоштаммовые, которые состоят из нескольких штаммов (двухштаммовые, трехштаммовые и т.д.);
• числу видов микроорганизмов, включаемых в состав заквасок: одновидовые (в составе только один вид); многовидовые (в составе несколько видов);
• количеству жизнеспособных клеток в единице (дозе) закваски: традиционные, в которых количество клеток в 1 г составляет от десяти до сотен миллионов, и закваски прямого внесения или бактериальные концентраты (DVS, DVI), в которых количество клеток в 1 г составляет от десяти миллиардов до триллиона;
• способу получения: жидкие (массовая доля влаги 70–80 %); густые (массовая доля влаги 50 %), например дрожжевые культуры; замороженные; сухие, включая сухие гранулированные (массовая доля влаги не более 4 %).

Молочнокислые бактерии, применяемые в технологии ферментируемых видов молочной продукции, выполняют следующие функции:

• синтезируют ферменты, осуществляющие биохимические превращения компонентов исходного сырья в соединения, формируя при этом специфические физико-химические, органолептические и микробиологические показатели продуктов;
• способствуют ингибированию развития технически вредной, патогенной и условно-патогенной микрофлоры;
• повышают пищевую, в том числе и биологическую, ценность;
• могут придавать продукции пробиотические свойства;
• синтезируют витамины, бактериоцины, полисахариды, ферменты и другие биологически активные вещества;
• способствуют увеличению срока годности готового продукта;
• являются одним из факторов для создания молочной продукции нового поколения.

Участие молочнокислых бактерий в формировании физико-химических показателей молочной продукции заключается в создании определенной активной и титруемой кислотности, вязкости, окислительно-восстановительного потенциала. Органолептические показатели, а именно вкус, аромат и консистенция, формируются за счет ферментации углеводов с образованием молочной и других кислот; ароматических соединений (ацетоина, диацетила, летучих жирных кислот, эфиров, ацетальдегидов, 2–3-бутиленгликоля); синтеза экзополи сахаридов; газов (диоксида углерода, кислорода и др.). Микробиологические показатели формируются благодаря развитию молочнокислых бактерий в молочном сырье и продуцированию бактериоцинов и другой природы веществ, способствующих ингибированию посторонней (остаточной и вторичного обсеменения) микрофлоры.

Выполнение функционально-технологической роли молочнокислыми бактериями возможно при определенном количестве их внесения в начале процесса ферментации и в готовой продукции. Именно из-за важной роли молочнокислых бактерий их количество нормируется в готовой кисломолочной продукции. В соответствии с ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочной продукции» количество молочнокислых бактерий должно составлять для кисломолочных продуктов не менее 1•107 КОЕ/г (см3), в твороге – не менее 1•106 КОЕ/г. Исключением являются творог, произведенный с использованием ультрафильтрации или сепарирования, зерненый творог, творожная масса и сырки творожные, в которых количество молочнокислых микроорганизмов не нормируется, но в микроскопических препаратах, приготовленных из таких продуктов, должна присутствовать микрофлора, характерная для творожной закваски, а отсутствовать – посторонняя микрофлора. Количество молочнокислых бактерий определяют с использованием различных методов, изложенных в ГОСТах. В настоящее время утвержден ГОСТ 10444.11–2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов.

 

Контроль бифидобактерий в молочной продукции

Бифидобактерии относятся к анаэробным пробиотическим микроорганизмам. В соответствии с действующими нормативными документами пробиотические микроорганизмы (пробиотики) – непатогенные, нетоксигенные микроорганизмы, поступающие в кишечник человека с пищей, благотворно воздействующие на организм человека и нормализующие состав и биологическую активность микрофлоры пищеварительного тракта (преимущественно микроорганизмов родов Bifidobacterium, Lactobacillus, Propionibacterium, Lactococcus).

Рассматривая способы производства кисломолочных продуктов с бифидобактериями, следует выделить следующие наиболее широко применяемые в промышленности: обогащение молочных продуктов заквасками бифидобактерий прямого внесения; получение кисломолочных продуктов путем непосредственной ферментации нормализованной смеси с использованием заквасок, включающих бифидо- и молочнокислые бактерии. Для того чтобы молочные продукты выполняли определенные функции в организме человека, количество бифидобактерий должно составлять не менее 1·106 КОЕ в 1 г или 1 см3 продукта. Данный показатель регламентируется в ТР ТС 033/2013 и относится к обязательным показателям, который следует контролировать в готовой молочной продукции с бифидобактериями.

Количество бифидобактерий определяют по ГОСТ ISO 29981–2013 «Продукты молочные. Подсчет презумптивных бифидобактерий. Метод определения количества колоний при температуре 37 °С». На территории России количество бифидобактерий также можно определять по ГОСТ Р 51331–99 «Продукты молочные. Йогурты. Общие технические условия». Сущность метода заключается в способности бифидобактерий расти на селективных плотных питательных средах в условиях анаэростата или на полужидких питательных средах, разлитых в пробирки высоким столбиком, при 38+-1 °С и образовывать в них через 48–72 ч колонии с типичными для бифидобактерий морфологическими характеристиками. В кисломолочных продуктах с бифидобактериями бифидум количество клеток можно определять по ГОСТ Р 52687–2006 «Продукты кисломолочные, обогащенные бифидобактериями бифидум. Технические условия».

 

Контроль дрожжей и плесневых грибов

Дрожжи и плесневые грибы влияют на показатели качества молока и молочной продукции. Полезное их действие проявляется при применении специальных культур дрожжей в качестве микрофлоры в технологии таких видов кисломолочных продуктов, как кефир (дрожжи входят в состав кефирного грибка), кумыс, «Тан», «Айран» и др. Плесневые грибы используются также в производстве некоторых видов мягких сыров. Однако многие воспринимают дрожжи и плесневые грибы прежде всего как возбудителей порчи и пороков молочной продукции. Таким образом, дрожжи и плесневые грибы могут оказывать как положительное, так и отрицательное действие на формирование показателей качества молочной продукции. Это обусловливает необходимость контроля дрожжей и плесневых грибов в продукции и производственной среде.

Дрожжи являются основными возбудителями спиртового брожения. Наибольшее значение в молочной отрасли имеют дрожжи, относящиеся к роду Saccharomyces. В молочной продукции выявляются как спорообразующие, так и неспорообразующие (аспорогенные) дрожжи.

Дрожжи и плесневые грибы относятся к факультативным анаэробам, но лучше развиваются при наличии в среде кислорода. Оптимальная температура развития дрожжей и плесневых грибов 25–30 °С, но некоторые их них могут развиваться при более низких температурах – 5–12 °С и даже при минус 3 °С. В кефирном грибке в основном присутствуют дрожжи, сбраживающие лактозу, которые достаточно активно развиваются при 18–20 °С. Дрожжи, сбраживающие лактозу, в совокупности с другой полезной микрофлорой кефирного грибка, способствуют получению кефира с выраженным вкусом и ароматом, который отличается от продукта, вырабатываемого при использовании дрожжей, несбраживающих лактозу и применяемых производителями при получении кефирного напитка. Именно поэтому в кефире нормируется количество дрожжей.

Однако «дикие» дрожжи (не используемые в составе полезной микрофлоры), попадая в молочную продукцию из различных источников, могут вызывать следующие пороки:

• сильное газообразование, приводящее к брожению продукции, вздутию потребительской тары;
• дрожжевой неприятный привкус в молоке, сметане, твороге и продуктах из него, сырах и сырных продуктах;
• бомбаж, более характерный для молочных консервов, в частности сгущенного молока с сахаром и др.;
• развиваясь в масле, образуют этиловый спирт и создают условия для развития уксуснокислых бактерий;
• при развитии на поверхности продуктов даже в условиях холодильного хранения могут образовывать внеклеточный полисахарид, что приводит к появлению слизи на продукции.

Наиболее часто «дикие» дрожжи попадают в продукцию из сахара или других компонентов, воздуха, с оборудования и других источников производства. Большинство дрожжей активно развивается в кислых питательных средах, поэтому они могут содержаться в разных видах кисломолочной продукции. Их количество нормируется в ТР ТС 033/2013 и должно контролироваться в лаборатории молочного предприятия.

В продуктах из животного сырья, включая молочную продукцию, чаще всего применяют плесени родов Thamnidium, Rhizopus, Cladosporium, Mucor, Oidium lactis, Penicillium, Aspergillus, Geotrichum и др. В качестве полезной микрофлоры специальные штаммы плесневых грибов и препараты с микрофлорой сырной слизи применяют в биотехнологии сыров с плесневыми грибами и со слизью: «Рокфор», «Камамбер» и др., в том числе со слизью красного цвета. В биотехнологии сыров наиболее широко используют Penicillium roqueforti, Penicillium camеmberti, Penicillium candidum, Penicillium album, Brevibacterium linens. Плесневые грибы позволяют получать сыры с ярко выраженными специфическими органолептическими показателями.

Однако плесневые грибы могут вызывать пороки:

• плесневение продукции: масла, сметаны, творога, сухих молочных продуктов; нарушение корки сыров; образование «пуговиц» в сгущенном молоке с сахаром;
• горький вкус и затхлый запах.

Наиболее благоприятные условия для развития плесневых грибов – свободный доступ кислорода и кислая реакция среды, поэтому для борьбы с ними следует применять не только тепловую обработку, но и создание атмосферы с наибольшим содержанием углекислого газа, пониженной влажностью воздуха и поддержанием низких температур в камерах хранения готовой продукции.

Содержание плесневых грибов и дрожжей как возбудителей пороков и порчи нормируется в продукции и воздухе производственной среды. Дрожжи и плесневые грибы контролируют по ГОСТ 10444.12–2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов» и (или) по ГОСТ 33566–2015 «Молоко и молочная продукция. Определение дрожжей и плесневых грибов», который введен в действие в качестве национального стандарта РФ с 01.07.2016 г. Методы, изложенные в стандартах, основаны на способности дрожжей и плесневых грибов развиваться на жидких и плотных питательных средах определенного состава. Наиболее широко применяют среду Сабуро с добавлением или без антибиотиков в зависимости от вида контролируемой продукции или питательную среду DRBC (ГОСТ 10444.12–2013). На плотных питательных средах образуются видимые характерные колонии через 3–5 сут культивирования при 25–30 °С. Колонии дрожжей и плесневых грибов разделяют визуально. Рост дрожжей на плотных средах сопровождается образованием крупных, выпуклых, блестящих, серовато-белых колоний с гладкой поверхностью и ровным краем; плесневых грибов – появлением мицелия различной окраски. В случае сомнения необходимо микроскопирование препаратов, приготовленных из колоний, выросших на чашках Петри с питательной средой. При определении дрожжей и плесневых грибов необходимо использовать отдельный термостат.

Всегда следует помнить, что для получения объективных результатов необходимо внимательно и грамотно применять действующие стандарты.

 

Методы идентификации микроорганизмов при контроле молочной продукции

 

К важнейшим показателям безопасности молока и молочной продукции для потребителей относят микробиологические показатели. Молочное сырье содержит белки, жиры, углеводы, витамины, макро- и микроэлементы, т.е. является очень хорошей питательной средой для развития микроорганизмов различных таксономических групп. Именно поэтому молоко и молочную продукцию относят к одним из важнейших групп продукции, которая может вызывать кишечно-желудочные заболевания у населения.

В молоке и молочной продукции могут содержаться:

• санитарно-показательные микроорганизмы: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы; бактерии группы кишечных палочек (БГКП, колиформы), Clostridium perfringens;
• условно-патогенные микроорганизмы – E. coli, Staph. аureus, Enterobacteriaceae sakazakii и Bacillus cereus;
• патогенные микроорганизмы – сальмонеллы, Listeria monocytogenes;
• микроорганизмы порчи – дрожжи и плесневые грибы, маслянокислые бактерии (их контролируют при возникновении порока в сырах – «позднее вспучивание»), термоустойчивые молочнокислые палочки (их контролируют при возникновении порока «излишняя кислотность»);
• полезная микрофлора (для кисломолочной продукции) – молочнокислые бактерии, бифидобактерии, дрожжи (в случае их применения в технологии получения продуктов);
• бактериофаги молочнокислых бактерий – их контролируют при выявлении причин торможения и (или) полной приостановки процессов сквашивания (ферментации) при получении кисломолочной продукции и ухудшении качества сыров при созревании;
• покоящиеся формы микроорганизмов – их контролируют при возникновении пороков и порчи в ультрапастеризованном молоке, стерилизованном молоке и других молочных продуктах с длительными сроками годности, включая продукты для детского питания.

В соответствии с ТР ТС 021/2011 и ТР ТС 033/2013 в молоке и молочной продукции нормируются, а поэтому подвергаются контролю следующие микроорганизмы: количество мезофильных, аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), БГКП (колиформы), бактерии группы кишечных палочек (E. coli), Staph. аureus, Enterobacteriaceae sakazakii и Bacillus cereus (только в детских продуктах), Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens (в пищевых казеинатах), молочнокислые бактерии, бифидобактерии, дрожжи, плесени.

При контроле полезных и посторонних микроорганизмов, нормируемых в молочной продукции, важным является учет бактерий конкретных родов и видов. В нормативной документации, в которой излагаются методы контроля тех или иных микроорганизмов, описываются их характеристики. На практике микробиологи иногда сталкиваются с затруднениями идентификации контролируемого и учитываемого микроорганизма, поэтому следует применять дополнительные методы, обеспечивающие получение объективных результатов контроля продукции. Неправильные идентификация и учет микроорганизмов в продукции могут приводить как к излишнему браку, так и выпуску опасной для потребителей продукции.

Идентификация

При идентификации следует учитывать следующие свойства выделенных колоний микроорганизмов: морфологические, тинкториальные, физиологические, биохимические, генетические и филогенетическую характеристику.

Для получения достоверных результатов используют традиционные и экспресс-методы, позволяющие оценить отдельные свойства или совокупность свойств идентифицируемого микроорганизма. Могут быть использованы биохимические и иммунологические тест-системы, идентификационные автоматизированные системы («Biolog», «Omnilog» и др.), ПЦР-технологии, методы флюоресцентной цитометрии, пластины «Петрифильм», хромогенные питательные среды, а также любые современные методы идентификации микроорганизмов.

В настоящее время в микробиологической практике при идентификации контролируемых микроорганизмов в пищевых продуктах наибольшее распространение получили различные стрип-системы. Система быстрой идентификации микроорганизмов с применением диагностических полосок (стрипов) API широко используется в мире. Точность идентификации микроорганизмов с применением полосок API достигает 100 %. Определение родовой и видовой принадлежности микроорганизмов после 4–48 ч инкубации проводится с помощью аналитического каталога (profile index) или приборов автоматической идентификации. Стрип-системы – это автоматическая версия API полос. Стрип-системы и полоски содержат готовую стерильную определенную питательную среду с реагентами (индикаторами, углеводами и др.) в зависимости от идентифицируемого микроорганизма. Назначение стрип-системы, включая биохимические тест-системы, – качественное определение (идентификация) микроорганизмов.

Применение тест-систем позволяет определять: энтеробактерии, анаэробные микроорганизмы, дрожжевые и плесневые грибы, грамотрицательные палочки, стафилококки, стрептококки. Сущность метода заключается в протекании биохимических реакций в результате развития микроорганизмов, содержащихся в образцах и помещенных в стрип-системы или на полоски, когда происходит синтез продуктов метаболизма, которые приводят к изменению питательной среды. Например, в основе системы идентификации «Biolog» лежит технология мультисубстратного тестирования, т.е. турбидиметрической и колориметрической детекции развития культур в присутствии различных химических тест-субстратов с использованием редокс-индикатора, который реагирует на метаболическую активность клеток. Такими субстратами могут являться источники основных биофильных элементов (углерода, азота, серы, фосфора), физиологически активные вещества (витамины, гормоны, ингибиторы роста, в том числе антибиотики, и др.), вещества, влияющие на осмотические свойства или кислотность среды, интермедиаты основных метаболических путей и т.д. Тестовые субстраты скомпонованы в панели на базе стандартных 96-луночных микропланшет.

В практике идентификации и выявления патогенных микроорганизмов применяют иммунологические методы. Иммунологический метод рекомендуется использовать для выявления бактерий рода Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter, веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli в пищевых продуктах и продовольственном сырье, водных объектах. Для этих целей предлагают использовать иммунохроматографические экспресс-тесты Merck (фирма Duopont и Singlepath, Германия) в соответствии с Методическими рекомендациями Федерального центра Госсанэпиднадзора Минздрава России № 24 ФЦ/976 (дата введения с 4.03.2004 г.).

Контроль производства молочной продукции

Микробиологический контроль проводят на тех этапах технологического процесса, на которых могут возникать биологические риски. Такие этапы (критические контрольные точки) технологического процесса устанавливаются сотрудниками микробиологической лаборатории совместно с технологами и должны быть внесены в Программу производственного контроля, которая утверждается руководителем предприятия. Типовыми критическими контрольными точками по ходу технологического процесса, как правило, являются этапы технологии:

а) контроль нормализованной молочной (молокосодержащей) смеси: до и после тепловой обработки (пастеризации, ультрапастеризации, стерилизации) при выходе из установки; после тепловой обработки из резервуара (до розлива, перед направлением на ультрапастеризацию или стерилизацию, до и после внесения закваски, перед вакуум-аппаратом или другими промежуточными емкостями); при производстве мороженого – до и после созревания смеси, после фризерования, перед упаковкой; при производстве масла методом сбивания – сливки после охладителя и перед сбиванием, метод преобразования высокожирных сливок – сливки высокожирные из сепаратора и после нормализации;

б) после образования сгустка в резервуаре (сыроизготовителе или другой емкости);

в) творог или творожный продукт (отделение сыворотки на сепараторе или после ультрафильтрации), сыр или сырный продукт после прессования;

г) при производстве сгущенных и сухих молочных (молокосодержащих) консервов – сгущенные молочные (молокосодержащие) консервы из вакуум-аппарата, разливочной машины, сгущенное молоко перед и после сушки;

д) продукция перед фасовкой;

е) готовая упакованная молочная и молокосодержащая продукция.

После пастеризации молочного (молокосодержащего) сырья контролируют эффективность пастеризации, которую оценивают по проценту остаточной микрофлоры, количеству мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в 1 см³, отсутствию бактерий группы кишечных палочек (БГКП) в 10 см³ молочного (молокосодержащего) сырья, отобранного после секции охлаждения пастеризационной установки; термограммам пастеризационных установок и (или) данным, фиксируемым в компьютере.

На всех этапах технологического процесса производства молочной (молокосодержащей) продукции контролируют санитарно-показательные микроорганизмы (КМАФАнМ, БГКП). В случае возникновения нештатных ситуаций рекомендуется определять и другие микроорганизмы (психротрофные, липолитические, протеолитические, маслянокислые и другие бактерии, термоустойчивые палочки), а также дрожжи и плесневые грибы. В случае выработки нестандартных продуктов по микробиологическим показателям контроль осуществляют до тех пор, пока не получат положительных результатов в течение трех выработок продукта подряд.

Периодичность (как правило, не реже 1 раза в месяц, а при производстве сыра и стерилизованного сгущенного молока – не реже 1 раза в декаду) и этапы контроля по ходу технологического процесса производства молочной продукции должны быть указаны в Программе производственного контроля.

Одновременно с контролем средних проб продукции, отобранных по ходу технологического процесса, контролируют немолочные компоненты, отобранные из камер, вспомогательные материалы (упаковочные материалы), а также санитарно-гигиеническое состояние. Особое внимание уделяют контролю качества и регулярности мойки резервуаров, оборудования для расфасовки продуктов и др.

Санитарно-гигиенический контроль производства включает контроль:

• качества мойки и дезинфекции оборудования, аппаратуры, инвентаря, результаты которого оценивают по КМАФАнМ и БГКП в смывах с оборудования непосредственно перед началом каждого технологического цикла;
• контроль рук и спецодежды работников на БГКП (без предварительного предупреждения перед началом технологического процесса);
• контроль воды на БГКП и КМАФАнМ. Вода для производства молока и молочной продукции должна соответствовать требованиям ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции»;
• контроль воздуха в производственных помещениях и на складах на КМАФАнМ, количество дрожжей и плесневых грибов. Аэромикрофлора производственных помещений представлена плесневыми грибами и их споровыми формами, дрожжами, пигментообразующими бактериями (например, микрококками), спорообразующими палочками рода Bacillus и др. Данные микроорганизмы могут привести к порокам, а также повлиять на безопасность, особенно той молочной продукции, которая подлежит длительному хранению;
• контроль фагового фона по ходу технологического процесса (рекомендуется проводить не реже 1 раза в декаду).

 

Микробиологические показатели готовой молочной продукции

 

Микробиологический контроль готовой молочной продукции – итоговый этап, который отражает общую картину организации производства и контроля продукции, соблюдения санитарно-гигиенических правил и норм на предприятии, своевременного выявления критических контрольных точек и проведение корректирующих мероприятий. Микробиологические показатели молочной продукции – это сумма остаточной микрофлоры и микроорганизмов вторичного обсеменения. В процессе производства молочной продукции на показатели качества и безопасности влияют следующие технологические факторы:

• режимы хранения и предварительной обработки молочного и молокосодержащего сырья, компонентов, смесей по рецептуре;
• режимы термической обработки (пастеризации, ультрапастеризации, стерилизации);
• перекачивание молочного и молокосодержащего сырья, молочной продукции внутри предприятия, смешивание сухих компонентов;
• сквашивание (ферментация) или свертывание молочного или молокосодержащего сырья, если она применяется в технологии продукции;
• охлаждение, созревание (молочного и молокосодержащего сырья, кефира, сметаны, сливок, смесей для мороженого, сыров и др.), прессование, посолка, сбивание, плавление сырной массы, сгущение, сушка и другие, которые предусмотрены в технологии продукции;
• промежуточное хранение и фасовка в потребительскую упаковку;
• условия хранения, транспортировки и реализации молочной продукции.

 

Наиболее часто в готовой молочной продукции при независимом контроле выявляют повышенное содержание бактерий группы кишечных палочек, дрожжей, количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов, а также недостаточное количество нормируемых полезных микроорганизмов (молочнокислых, бифидобактерий). В то же время следует отметить, что в продукции могут выявляться и ненормируемые термоустойчивые вирусы, грамположительные бактерии и др. Особое беспокойство вызывают палочки рода Bacillus cereus, Clostridium perfringens и разновидности клостридий, которые могут приводить не только к порче молочной продукции, но и отравлениям. Следует отметить, что эти бактерии хорошо сохраняются в сухом молоке, сухой сыворотке, а следовательно, и в продуктах, получаемых с применением данного молочного сырья. Сухое обезжиренное и цельное молоко, сухая сыворотка широко применяются на предприятиях при выработке продукции, а значит, такая продукция должна обязательно подвергаться тщательному контролю. Чем более широкий спектр сырья и компонентов применяется в технологии продукции, тем более разнообразные микроорганизмы и продукты их жизнедеятельности могут присутствовать в готовой продукции и влиять на ее показатели качества и безопасности.

Важным этапом в получении стандартной продукции по микробиологическим показателям является фасование. При нарушении порядка и правил фасования (обеззараживание упаковочных материалов, соблюдение норм чистоты воздуха, герметичности упаковки, добавление нестандартных фруктовых или овощных компонентов и др.) продукции, которая прошла технологический цикл, может происходить обсеменение микроорганизмами и грибами (дрожжевыми и (или) плесневыми), что, несомненно, приведет к ухудшению качества, снижению безопасности, сокращению ее сроков годности.

Хочется обратить внимание и на соблюдение условий хранения, транспортировки и реализации молочной продукции. Главное при хранении молочной продукции – соблюдение условий, а именно:

• температурного режима;
• относительной влажности воздуха;
• целостности упаковки продукции;
• условий погрузки и разгрузки продукции.

В процессе охлаждения, созревания и хранения молочных продуктов может увеличиваться количество микрофлоры: психрофильной, психротрофной, мезофильной. Это, в свою очередь, ведет к увеличению количества и спектра ферментов, содержания токсичных веществ, продуцируемых бактериями, биохимическим изменениям составных веществ молочных продуктов, ухудшению органолептических и микробиологических показателей готовой продукции. Важным показателем для развития микроорганизмов является их минимальная температура роста (minimum growth temperature, MGT) в охлажденных продуктах.

Хранение молочных продуктов при температурах ниже минимальных для роста не следует рассматривать как летальные условия для микроорганизмов, находящихся в продуктах, так как их рост может возобновляться при последующем повышении температуры, что происходит чаще всего при транспортировке продуктов и в торговле. При низких температурах скорость отмирания часто снижается, и поэтому микроорганизмы могут жить дольше, чем при более высокой температуре (выше 15 °С). В молочной продукции, охлажденной до 8 °С и выше, развиваются грамположительные кокки и палочки, а при температуре ниже 8 °С преобладают психротрофные грамотрицательные палочковидные бактерии (чаще всего Pseudomonos). Таким образом, учитывая факторы, влияющие на микробиологические показатели, молочная продукция должна иметь меньшее количество посторонних микроорганизмов, установленных в нормативно-правовых документах.

Микробиологические показатели в зависимости от вида молочной продукции контролируют в соответствии с ТР ТС 021/2011, ТР ТС 033/2013 или ТР ТС 027/2012. В тех видахы продукции, в технологии которой не применяют заквасочные микроорганизмы, нормируется и должно контролироваться в лаборатории предприятия количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. В большинстве видов молочной продукции (за исключением ультрапастеризованных и стерилизованных продуктов) нормируются бактерии группы кишечных палочек, которые контролируют в микробиологической лаборатории предприятия. Нормируемое в некоторых видах молочной продукции количество дрожжей и плесеней как возбудителей порчи контролирует также лаборатория предприятия. Патогенные микроорганизмы, в том числе сальмонеллы, листерии (L. monocytogenes), стафилококки (Staph. aureus) и другие нормируемые микроорганизмы в молочной продукции контролируют в специально аккредитованной лаборатории, находящейся на территории предприятия или чаще всего в лабораториях Роспотребнадзора, Россельхознадзора, Центров стандартизации и метрологии (ЦСМ) или других независимых лабораториях в соответствии с заключенным договором.

 

Материал подготовлен

доктором технических наук

В.И. Ганиной

Московский Государственный Университет

технологий и управления им. К.Г. Разумовского